Spektrofotometri UV-VIS
2.5.2 Aspek Kualitatif dan Kuantitatif Spektrofotometri UV-VIS
Spektra UV-Vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
a. Aspek Kualitatif
Data dari spektra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabung dengan cara lain seperti spektroskopi infra merah resonansi magnet inti, dan spektroskopi massa, maka dapat digunakan untuk maksud identifikasi/analisis kualitatif suatu senyawa tersebut. Data yang diperoleh dari spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal, intensitas, efek pH, dan pelarut; yang kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan data yang sudah dipublikasikan (Gandjar & Rohman,2007).
b. Aspek Kuantitatif
Dalam aspek kuantitaitif, suatu berkas radiasi dikenakan pada cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas sinar yang diteruskan dengan intensitas sinar yang diserap. Serapan dapat terjadi jika foton/radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energy yang sama dengan energi yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan dengan adanya penghamburan dan pemantulan cahaya, akan tetapi penurunan karena hal ini sangat kecil disbandingkan dengan proses penyerapan. Jika sinar monokromatik dilewatkan melalui suatu lapisan larutan dengan ketebalan db, maka penurunan intensitas sinar (dl) karena melewati lapisan larutan tersebut berbanding langsung dengan intensitas radiasi (l), konsentrasi spesies yang menyerap (c), dan dengan ketebalan lapisan larutan (db). Secara matematis, pernyataan ini dapat dituliskan:
-dl = kIcdb
Dengan merubah menjadi logaritma basis 10, maka akan didapatkan persamaan:
I = Io 10 –kbc
Yang mana k / 2,303 = a, maka persamaan (10-10) di atas dapat diubah menjadi persamaan:
Log Io/I = abc
A = abc
Yang mana:
A= absorban
a = absorptivitas
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi
Persamaan ini dikenal dengan hukum Lambert-Beer (Gandjar & Rohman,2007).
2.5.3 Hukum Lambert-Beer
Pengukuran serapan cahaya oleh larutan molekul diatur denngan Hukum Lambert-Beer, yang ditulis sebagai berikut:
Log Io/It = A = bc
Dengan Io adalah intensitas radiasi yang masuk; It adalah intensitas radiasi yang ditransmisikan; A dikenal sebagai absorbans dan merupakan ukuran jumlah cahaya yang diserap oleh sampel; adalah tetapan yang dikenal sebagai koefisien punahan molar dan merupakan absorbans larutan 1 M analit tersebut; b adalah panjang jalur sel dalam cm, biasanya 1 cm; dan c adalah konsentrasi analit dalam mol per liter.
Dalam produk farmasi, konsentrasi dan jumlah biasanya dinyatakan dalam gram atau milligram dan bukan dalam mol sehingga untuk keperluan analisis produk ini, hokum Lambert-Beer ditulis dalam bentuk sebagai berikut ini:
A = A (1%, 1cm) bc
A adalah absorbans yang diukur; A (1%, 1cm) adalah absorbans larutan 1% b/v (1 g/100ml) dalam suatu sel berukuran 1 cm; b adalah panjang jalur dalam cm (biasanya 1 cm); dan c adalah konsentrasi sampel dalam g/100ml. karena pengukuran biasanya dibuat dalam sel berukuran 1 cm, persamaan tersebut dapat ditulis:
[ c = A / A (1%, 1cm)] yang menghasilkan konsentrasi analit dalam g/100 ml (Watson,2009).
2.5.4 Instrumentasi
Suatu spektrofotometer UV/visible memiliki komponen sebagai berikut:
Sumber cahaya – lampu deuterium untuk daerah UV dari 190 sampai 350 nm dan lampu halogen kuartz atau lampu tungsten untuk daerah visible dari 350 sampai 900 nm.
Monokromator – digunakan untuk menghamburkan cahaya ke dalam panjang gelombang unsur-unsurnya, yang diseleksi lebih lanjut dengan celah. Monokromator berotasi sehingga rentang panjang gelombang dilewatkan melalui sampel ketika instrument tersebut memindai sepanjang spektrum.
Optik – dirancang untuk memisahkan berkas cahaya sehingga berkas tersebut melewati dua kompartemen sampel, dan pada instrumen berkas rangkap tersebut, larutan blangko dapat digunakan dalam satu kompartemen untuk memperbaiki pembacaan atau spektrum sampel tersebut. Blangko umumnya adalah pelarut yang dapat melarutkan sampel (Watson, 2009).
2.5.5 Instrumen diode array
Suatu tabung foto pengganda digunakan untuk deteksi pada jenis instrument UV/visibel yang lebih kuno, tapi fotodiode semakin banyak digunakan sebagai detektor pada spektrofotometer. Suatu diode array terdiri atas serangkaian detector fotodiode yang posisinya berdampingan dengan kristal silikon. Susunan tersebut biasanya mengandung antara 200 dan 100 elemen, tergantung pada instrumennya. Siklus pindai lebih kurang 100 milidetik, dibandingkan dengan siklus dalam menit atau lebih yang diperlukan untuk menghasilkan suatu spektrum dengan instrumen pemindaian tradisional. Cahaya dilewatkan melalui suatu polikromator, yang menghamburkannya sehingga jatuh pada diode array , yang mengukur seluruh rentang spektrum sekaligus (Watson, 2009).