Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
2.5.1 Definisi Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi merupakan suatu prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis salam sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorbsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion, sehingga masing-masing zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Depkes, 1995).
2.5.2 Prinsip Pemisahan pada KLT
Pemisahan kromatografi planar (kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis) pada umumnya dihentikan sebelum semua fase gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini dikarakterisasi dengan jarak migrasi solute terhadap jarak ujung fase geraknya.
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan akan dicapai ketika solute mempunyai perbandingan distribusi (D) dan faktor retensi (k’) sama dengan 0 yanng berarti solute bermigrasi dengan kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan akan tercapai jika solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam, sedangkan pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak yang disebut desorpsi. Proses ini terjadi selama pemisahan kromatografi karena sistemnya berada dalam kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga keadaan kesetimbangan ini. Ada 4 jenis mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2 atau lebih mekanisme ini terjadi dalam 1 jenis kromatografi. Mekanisme tersebut yaitu adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran.
1. Adsorpsi
Adsorpsi merupakan penyerapan pada permukaannya saja. Adsorpsi pada permukaan melibatkan interaksi-interaksi elektrostatik seperti ikatan hydrogen, penarikan dipole-dipol, dan penarikan yang diinduksi oleh dipole. Solut akan bersaing dengan fase gerak untuk berikatan dengan sisi-sisi polar pada permukaan adsorben. Adsorpsi solute oleh fase diam atau oleh adsorben sangat tergantung pada (a) struktur kimia solut atau adanya gugus aktif tertentu yang berinteraksi dengan adsorben; (b) ukuran partikel adsorben. Semakin kecil ukuran partikel adsorben, maka luas permukaannya semakin luas sehingga interaksinya dengan solute juga semakin luas; (c) kelarutan solut dalam fase gerak. Solut yang makin mudah larut dalam fase gerak akan semakin mudah lepas dari fase diam (Gandjar & Rohman, 2007).
2. Partisi
Partisi merupakan proses sorpsi yang analog dengan ekstraksi pelarut. Fase diam cair diikatkan pada padatan lapis tipis yang inert. Karena fase diam cair diikatkan pada padatan pendukung maka masih diperdebatkan apakah proses sorpsinya merupakan partisi murni atau partisi yang dimodifikasi (modified partition) karena adsorpsi juga mungkin terjadi. Dalam partisi yang sebenarnya (true partition ) solut akan terdistribusi diantara fase gerak dan fase diam sesuai dengan kelarutan relative diantara keduanya. Mekanisme ini hanya terjadi dalam kromatografi gas-cair (Gandjar & Rohman, 2007).
3. Pertukaran ion
Pertukaran ion merupakan proses yang mana solute-solut ion dalam fase gerak dapat bertukar dengan ion-ion yang bermuatan sama yang terikat secara kimiawi pada fase diam. Fase diam dapat berupa padatan polimer yang permiabel seperti resin organik yang tidak larut atau silika yang dimodifikasi secara kimiawi. Fase diam ini mengandung gugus-gugus dengan muatan yang tetap dan ion-ion lawan yang mobile(Gandjar & Rohman, 2007).
4. Ekslusi
Eklusi berbeda dengan mekanisme sorpsi yang lain, yaitu dalam ekslusi tidak ada interaksi spesifik antara solut dengan fase diam. Teknik pemisahan ini berdasarkan pada ukuran molekul dari zat pengepak (fase diam). Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert.Sebagai fase gerak digunakan cairan. Kromatogram jenis ini sangat dipengaruhi oleh perbedaan bentuk struktur dan ukuran molekul (Gandjar & Rohman, 2007).