Metode Spektrofotometri UV – Vis
Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian, spektra UV dan spektra Vis dikatakan sebagai spektra elektronik. Keadaan energi yang paling rendah disebut dengan keadaan dasar (ground state). Transisi – transisi akan meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat energi tereksitasi (Gandjar dan Rohman, 2007). Serapan radiasi UV – Vis terjadi melalui eksitasi elektron – elektron di dalam struktur molekular menjadi keadaan energi yang lebih tinggi (Watson D. G., 2005). Semua molekul dapat mengabsorbsi radiasi dalam daerah UV – Vis karena mereka mengandung elekton, baik sekutu maupun menyendiri, yang dapat dieksitasikan ke tingkat energi yang lebih tinggi. Panjang gelombang dimana absorbsi itu terjadi bergantung pada berapa kuat elektron itu terikat dalam molekul itu (Day dan Underwood, 2002).
2.1.1. Instrumentasi
2.1.1.1. Sumber cahaya
Sumber cahaya lampu deuterium untuk daerah UV dari 190 sampai 350nm dan lampu halogen kuartz atau lampu tungsten untuk daearah visibel dari 350 sampai 900nm (Gandjar dan Rohman, 2007; Watson D. G., 2005).
Sumber lampu yang paling lazim adalah lampu tabung discas (discharge tube) hidrogen atau deuterium yang digunakan dari kira – kira 175 ke 375 atau 400 nm. Bila suatu discas antara dua elektroda mengeksitasi pancaran cahaya oleh suatu sampel gas seperti hidrogen, akan diperoleh suatu karakteristik spektrum garis yang tak sinambung (diskontinu) dari gas itu, asal saja tekanannya relatif rendah, jika tekanan hidrogen dinaikkan, garis – garis itu melebar dan akhirnya tumpang tindih sampai dipancarkan spektrum yang berkesinambungan pada tekanan yang relatif tinggi (Day dan Underwood, 2002).
2.1.1.2. Celah
Radiasi dari sumber difokuskan celah masuk, kemudian spektrum yang dihasilkan oleh unsur dispersi dipusatkan pada celah keluar. Celah yang disempitkan tidak cukup melewatkan energi untuk mengaktifkan detektor. Celah yang lebih lebar akan mencapai derajat kemurnian spektral yang sama seperti celah yang lebih sempit pada panjang gelombang yang lebih panjang (Day dan Underwood, 2002).
2.1.1.3. Monokromator
Monokromator adalah piranti optis untuk mengisolasi suatu berkas radiasi dari suatu sumber berkesinambungan yang mempunyai kemurnian spektral yang tinggi dengan panjang gelombang apa saja yang diinginkan. Komponen penting dari sebuah monokromator adalah suatu sistem celah dan suatu unsur dispersif. (Day dan Underwood, 2002).
Monokromator digunakan untuk menghamburkan cahaya kedalam panjang gelombang unsur – unsurnya, yang diseleksi lebih lanjut dengan celah (Watson D. G., 2005). Radiasi dari sumber difokuskan ke celah masuk, kemudian disejajarkan oleh sebuah lensa atau cermin sehingga suatu berkas sejajar jatuh ke unsur pendispersi yang berupa prisma atau kisi difraksi (Day dan Underwood, 2002). Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga rentang panjang gelombang dilewatkan melalui sampel ketika instrumen tersebut melewati spektrum (Watson D. G., 2005). Dengan memutar prisma atau kisi itu secara mekanis, aneka porsi spektrum yang dihasilkan oleh unsur dispersi dipusatkan pada celah keluar, kemudian dilewatkan pada sampel. Kemurnian spektral dan radiasi yang keluar dari dalam monokromator bergantung pada daya dispersi dari prisma dan lebar celah keluar (Day dan Underwood, 2002).
2.1.1.3. Sel
Kebanyakan spektrofotometri melibatkan larutan, dan karenanya kebanyakan wadah sampel adalah sel untuk menaruh cairan kedalam berkas cahaya spektrofotometer. Sel itu haruslah meneruskan energi radiasi dalam daerah spektral yang diminati. Sel kaca melayani daerah visibel, sel kuarsa atau kaca silika tinggi istimewa untuk daerah ultraviolet.
Sel merupakan wadah sampel, akan tetapi jika sel diletakkan pada posisinya, sel menjadi bagian dari lintasan optis dalam spektrofotometer. Sel – sel lebih baik bila permukaan optisnya datar. Sel – sel harus diisi sedemikian rupa sehingga berkas cahaya menembus larutan dengan meniskus terletak seluruhnya diatas berkas.
Sel untuk spektrofotometer UV – Vis adalah yang mempunyai panjang gelombang 1 cm, namun tersedia sel dengan ketebalan yang sangat beraneka, mulai dari lintasan yang sangat pendek, kurang dari 1 milimeter sampai 10 cm atau lebih (Day dan Underwood, 2002).
2.1.1.4. Detektor
Sebuah detektor untuk suatu spektrofotometer haruslah memiliki kepekaan yang tinggi dalam daerah spektral yang diminati, respon yang linier terhadap daya radiasi, waktu respon yang cepat, dapat digandakan dan kestabilan yang tinggi atau tingkat “noise” yang rendah, meskipun dalam praktiknya perlu untuk mengkompromikan faktor – faktor ini. Kepekaan yang tinggi misalnya, dapat dicapai hanya dengan menerima noise yang meningkat.
Macam – macam deteksi yang telah digunakan paling meluas, didasarkan pada perubahan fotokimia (terutama fotografi), efek fotolistrik dan efek termolistrik. Fotografi tidak lagi digunakan dalam spektrofotometri biasa; secara umum, detektor fotolistrik digunakan dalam daerah tampak dan ultraviolet.
Detektor fotolistrik yang paling sederhana adalah tabung foto yang berupa tabung hampa udara dengan jendela yang tembus cahaya yang berisi sepasang elektroda. Tabung pengganda foto (photomultiplier) lebih peka daripada tabung foto biasa karena penggandaan yang tinggi dicapai dangan tabung itu sendiri. Tabung semacam itu mempunyai sederet elektroda – elektroda yang potensial positifnya relatif terhadap katoda makin besar. Keluaran pengganda foto ini masih digandakan lebih lanjut dengan suatu penguat (amplifier) elektronik luar.kepekaan yang ditingkatkan dari detektor ini memungkinkan celah dalam monokromatornya disempitkan dan karena itu struktur halus spektralnya dapat dipisahkan dengan lebih baik (Day dan Underwood, 2002).